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      國產mRNA疫苗龍頭漸起,兩大核心技術值得關注!

      2021-09-29

      目前,國內暫無 mRNA 疫苗獲批上市,這一市場仍處于空白狀態。國內市場中,mRNA 疫苗研發進展最快的是艾博生物與沃森生物、軍科院共同研發的 ARCoV,以及復星醫藥從 BioNTech 引進的 BNT162b2等。

      在第二輪新冠疫苗需求到來之際,國產mRNA 疫苗的競爭將會打響。兩大核心技術是序列設計和遞送系統。

      mRNA 疫苗與滅活疫苗各有優勢,但不可否認的是 mRNA 疫苗借著新冠疫情的契機已經展示了自己的臨床潛力,并且在研發和生產上也具有獨特的優勢。

      mRNA 疫苗原理


      • 治療原理:“巧”用自身細胞加強特異性免疫

      DNA 本身無法直接對人體產生影響,各類蛋白質才是能夠左右表象的物質。

      mRNA 是 DNA 轉化為蛋白質的中間體。mRNA 類似于說明書,能夠指導自身細胞生產出特定的蛋白,但是 mRNA 的改變不會被分裂產生的新細胞繼承,也不會遺傳至下一代個體中。蛋白則是最終生產得到的工具,對生物個體的各項指標直接產生作用。這一條轉錄轉譯鏈被稱為生物學“中心法則”。

      mRNA 疫苗利用了兩步表達的機理,使疫苗在不改變 DNA 序列的同時,為人體免疫系統的激活提供更準確的抗原蛋白以及更持久的抗原體內留存時間, 使被激活的特異性免疫更精準,同時免疫效果得到鞏固。

      mRNA 疫苗中的 mRNA 片段編碼新冠病毒表面的某些蛋白或受體。

      疫苗遞送人工編輯后的 mRNA 進入人體細胞,在體內“借用”人體自身細胞轉譯 mRNA 為蛋白質。此類 mRNA 在經過轉譯后會表達成為病毒所具有的某種抗原蛋白。雖然產生的抗原是由自身細胞制造,但由于其氨基酸序列具有外源性,APC 中的 TLR 并不識別此段序列,因此仍舊會激發 B 細胞和 T 細胞針對此抗原蛋白的特異性免疫反應,并建立免疫記憶。

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      • LNP 遞送系統:遞送疫苗有效物質進入預定軌道的運載火箭

      mRNA 疫苗要發揮作用,必須先將編輯好的 mRNA 轉遞進細胞質中。

      mRNA 作為大分子,在不破壞細胞膜的前提下,進出細胞只能以內含體通過胞吞作用。為保證 mRNA 在轉譯前保持完整性,mRNA 需要在內含體與溶酶體結合前打破內含體包膜并逃離。逃離內含體進入細胞質后,mRNA 便會在細胞質內游動,直至到達核糖體并在此轉譯為肽鏈,最終折疊成為蛋白質。

      對于 mRNA 疫苗和藥物,遞送系統有兩大職責:一是有效包裹和保護 mRNA 在到達靶點前維持穩定, 二是幫助 mRNA 有效成分進入細胞,三是在 mRNA 到達溶酶體前將其釋放進入細胞質中。

      LNP 是目前最具潛力的遞送載體之一。LNP是脂質微粒的總稱,其中又包括脂質膠團、脂質體等。LNP 與細胞膜的組成成分相似,均由脂質分子構成。脂質分子的兩條長尾通常呈平行狀態,脂質形成的雙分子層穩定。在進入細胞質酸性環境后, 部分脂質的頭部質子化,呈現陽離子形態,與其他陰性離子態的脂質分子相吸引,尾部張開。原本雙分子層的形式被破壞,形成頭部聚集在一起的環狀。之前包裹在內的 mRNA 便可逃逸出內含體, 進入細胞質等待轉譯。

      為了提高載體對包裹成分的保護能力,通過在載體外部連接 PEG 可以進一步增強載體的穩定性。

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      mRNA疫苗優劣勢分析


      • mRNA 疫苗 vs. 滅活疫苗:具有明顯的免疫保護力優勢

      mRNA 是將編碼病毒抗原的 mRNA 注入體內,由人體自身細胞產生對應的抗原,以此激活特異性免疫。

      mRNA 疫苗能夠呈現更多的抗原,同時能更持久地激活鞏固特異性免疫。原因在于mRNA 疫苗抗原呈遞的過程是可短暫持續的,呈遞的 mRNA 可指導多個核糖體產生抗原蛋白,直至 mRNA 降解。

      由于細胞能夠不斷根據 mRNA 生產抗原蛋 白,因此抗原數量受疫苗劑量所限制較小,從時間維度上看,抗原不會在短時間內迅速被消耗完畢??乖瓟盗克皆礁?、保持時長越長,形成的特異性免疫記憶越強烈,免疫應答更快、持續時間越長。


      • mRNA 疫苗 vs. DNA 疫苗:更高效,逆轉錄風險較小

      mRNA 疫苗更有效也更安全。

      DNA 疫苗需要將包裹的有效成分遞送通過多層屏障導致有效成分難以進入反應場所,免疫激活更難。mRNA 疫苗導入的外源物質不需進入細胞核,發生外源遺傳片段逆轉錄進入人體自身 DNA 的概率 較小,因此引起腫瘤癌癥的概率極小。


      • mRNA 疫苗 vs. 病毒載體疫苗:適用人群覆蓋全面,逆轉錄風險較小,機會成本更低

      LNP 為遞送 mRNA 片段到達靶點、定點釋放提供了支持。

      另一大受到較高關注度的載體平臺是病毒載體平臺,常見的類別有腺病毒、腺相關病毒、慢病毒。病毒載體反應的一大缺陷是,若接種者本身體內 含有針對此病毒載體的抗體,或在短時間內快速產生了抗體,則病毒載體疫苗無法將有效成分遞送進入預定的細胞質內。

      相比之下,LNP 的結構由脂質分子構成,載體引起免疫反應的幾率較小,能夠更有效地遞送有效成分至目標靶點。病毒載體疫苗具有更高的機會成本。當人體接受病毒載體疫苗注射后,體內會自動產生針對此載體的抗體和其他特異免疫反應。此后再次運用相同或相似病毒載體作為遞送系統給藥時,會更容易遭到免疫系統的攻擊,難以成功將藥物遞送至靶點。

      mRNA疫苗生產流程


      • 第一步:DNA 質粒制備

      mRNA 疫苗的生產可分為三大階段,一是 DNA 原液制備,二是 mRNA 原液的制備,三是利用脂質微粒進行包封。

      原液制備開始于質粒構建。通常使用的 DNA 質粒為環狀質粒,質粒上含有設計好的序列模塊。利用電流打破細胞膜,并將環狀 DNA 質粒引入大腸桿菌。大腸桿菌被儲藏于含有大量營養物質的溶液中進行繁殖擴增。提取并純化 DNA 質粒,過濾溶液,去除細菌及其他物質。利用酶將純化后的環狀 DNA 質粒切割為鏈狀。將所得溶液分裝冷藏,通過質量控制環節,并運送至下一階段的生產加工場所。

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      • 第二步:體外轉錄

      第二階段的目的是將 DNA 鏈轉化為 mRNA。上一步制備得到的 DNA 鏈與酶和核苷酸混合在 10 加侖容量的容器中,RNA 聚合酶會將 DNA 轉錄為 mRNA。得到 mRNA 后,DNA 以及其他物質將被濾除,mRNA 被裝進購物袋大小的塑料包裝中,每袋含有約 500 萬到 1000 萬劑次的 mRNA 原料。


      • 第三步:遞送系統裝載

      第三階段的流程目的是將 mRNA 包裹進脂質載體(LNP)中。脂質懸浮于酒精溶液中,與 mRNA 接觸并將其包裹,兩種物質通過相反電荷相吸引。之后,原液經過切向流過濾(TFF)濾除溶液中多余的脂質、酒精等雜質,并制成最終的 mRNA 疫苗溶液。此階段是 mRNA 疫苗生產的最大瓶頸之一,其中一個重要原因是市場上提供脂質的廠商有限,因此輝瑞已開始自主研發制造脂質。


      • 第四步:灌裝檢驗

      在上述三個生產階段都完成后,mRNA 疫苗原液已完成,只待灌裝分發。隨后,經過 2 周的純凈度檢測及其他安全性檢測,疫苗便能銷往世界各地。以上所有生產灌裝環節耗時約 64 天。


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      mRNA疫苗兩大核心競爭力



      mRNA疫苗對于需求端相較于其他技術路徑疫苗的優勢與不足,可以確定的是mRNA 在需求端的吸引力正在不斷上升。在供給端決定 mRNA 疫苗競爭格局的要點與瓶頸集中在兩大因素上:mRNA 序列結構和疫苗遞送系統。


      • mRNA 序列結構決定抗原蛋白結構、免疫原性及穩定性


      疫苗產生的抗原蛋白的序列以及穩定性決定了其激活的特異免疫的精確性和活性。而抗原蛋白的序列和結構則由 mRNA 序列影響和控制。mRNA 序列決定了疫苗的質量,也是 mRNA 疫苗廠商的核心競爭力之一。

      編碼區域決定了蛋白質中的氨基酸序列。部分密碼子組合會轉譯成同一種氨基酸,但在不同生物族群中,會存在對某一密碼子組的偏好,此密碼子組合的免疫原性較小,不易遭到酶類的攻擊,而它的同義密碼子則可能引起過敏反應并且導致質量下降。因此 CAA 相較而言更有可能觸發免疫反應。

      因此,mRNA 疫苗需要選擇最接近人源性的同義密碼子,規避可能引起過敏反應的組合以保證安全性和轉譯質量。非轉譯區則調控 mRNA 和 蛋白質的穩定性以及表達效率。

      mRNA 序列是疫苗研發中的重點,也是行業內競爭的核心。除了含有抗原蛋白編碼外,序列其他部分也直接影響 mRNA 疫苗的質量。

      編碼前后的非轉譯區負責調控轉譯以及蛋白表達,對 mRNA 的轉譯效率、半衰期、最高表達 水平等數值有影響。UTR 中的 GC 水平、U 水平均會影響 mRNA 的免疫原性,對疫苗的安全性和能否正常產生抗原造成影響。UTR 需要在 DNA 質粒建立時包含在序列中,屬于序列設計的一部分。

      多聚 A 尾能夠提高 mRNA 的穩定性和轉譯效率。腺苷能夠降低核糖核酸酶的效率,以此減緩 mRNA 的降解速度。多聚 A 尾可在建立 DNA 質粒時直接包含于編碼中,也可在 DNA 轉錄為 mRNA 后通過聚合酶添加于 mRNA 尾部。

      位于 mRNA 最前端的 5’帽結構對于降低 mRNA 免疫原性,增強穩定性和翻譯效率有正面影響。在體外轉錄過程中,mRNA5’ 端會含有三磷酸鹽部分,具有很強的免疫原性。加帽過程可在 DNA 轉錄為 mRNA 的生產過程中或過程后進行,利用抗反向帽類似物將 5’帽結構按正確方向固定在 mRNA 的 5’端。但是此過程不能保證三磷酸鹽完全被去除,所以仍舊存在引起細胞內免疫反應的風險,因此加帽工藝對疫苗的安全性有直接影響。


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      • 遞送系統是目前產能擴張的瓶頸


      作為 mRNA 疫苗的傳遞介質的一大難點是 mRNA 以內含 體的形式進入細胞質后,需要打破內含體包膜,釋放 mRNA。目前 LNP 供應商較少,且其中專利糾紛因此成為 mRNA 新冠疫苗快速放量的一大掣肘。

      LNP 專利成為 mRNA 疫苗行業商業權利的主要紛爭來源

      BioNTech 和 Moderna 的新冠疫苗中的 LNP 技術專利全部來自 Arbutus,Moderna 在新冠疫苗中使用的 LNP 技術大概率不包含在 Acuitas 被許可再授權的 4 個項目中。

      在其他載體均有明顯劣勢的情況下,LNP 是 mRNA 疫苗遞送的最佳選擇之一。因此,各廠商對 LNP 技術的掌握以及是否擁有相關專利成為了業內競爭中極其重要的一環。LNP 技術專利決定了 mRNA 疫苗企業在業內競爭中的地位。


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